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ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

1.ELISA原理和類型

抗體或抗原可以吸附在合適的載體上，酶標(biāo)記抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原抗體免疫復(fù)合物，在一定的底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成為另一種帶色物質(zhì)。由于在一定的條件下，酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的，因此可以應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。這就是Peter Perlmann 和Eva Engvall所建立的ELISA技術(shù)的原理。

按照所用固相載體的不同，ELISA又分為普通ELISA和Dot-ELISA.

招照抗體或抗原在固相載體上不同的吸附方法，又根據(jù)使用不同的抗體例如能與抗原直接反應(yīng)的抗體（通常稱為一抗），能與一抗起免疫結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)有酶的抗體（通常稱為酶標(biāo)二抗），ELISA分化出多項(xiàng)不同的測(cè)定方法。

ELISA一般分為下述幾種類型：

• 直接法：首先將抗原吸附于載體表面，然后將酶標(biāo)記抗體與該抗原反應(yīng)結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗原存在量。
• 間接法：首先將抗原吸附于載體表面，然后加抗血清，使特異性抗體（*抗體）與抗原結(jié)合，再加酶標(biāo)記抗球蛋白（第二抗體，即抗*抗體的抗體），與*抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗體存在量。
• 雙重抗體法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球蛋白致敏載體表面，然后加抗原溶液，使抗原與抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗體球蛋白，與被致敏載體表面吸附的抗原結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗原存在量。ELISA雙重抗體法也稱ELISA雙重抗體夾心法，該法能減弱非特異顏色的干擾，并且在測(cè)定時(shí)可不做空白對(duì)照。
• 酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球蛋白的致敏載體表面，然后加入以不同比例混合的抗原和酶標(biāo)記的抗原溶液，與吸附在載體上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成酶標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物和非標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物，zui后加入底物，通過酶的底物水解量(測(cè)定光密度而知)來(lái)確定未知溶液有無(wú)抗原及抗原量多少。

酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法利用混合的未標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗原相互競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合點(diǎn)，從而進(jìn)行抗原的定量。未標(biāo)記抗原的量越大，則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競(jìng)爭(zhēng)法在實(shí)驗(yàn)時(shí)比較復(fù)雜，有時(shí)在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后，在測(cè)定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前，要先進(jìn)行鹽析或有機(jī)溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后，容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此，每次測(cè)定時(shí)都需做空白對(duì)照。由于這些缺點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法使用不多。

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